María de Cazalla nació en 1487 en Palma del Río, una villa del señorío del Guadalquivir. Pertenecía a una familia -que la Inquisición identificaba como heterodoxa desde hacía largo tiempo- que se dedicaba a las finanzas, los negocios de la guerra y a la administración tanto real como municipal. No era una mujer común entre sus contemporáneos.

Era hija de Beatriz Cazalla, criada de Luis Fernández Portocarrero (VII señor de Palma del Río) y sobrina de Alonso de Cazalla, su mayordomo. Su madre y tíos trabajaron al servicio de los señores Portocarrero de Palma.

La familia Cazalla era un ejemplo de la burguesía rica y culta, de origen judeoconverso, en la que abundaban letrados y teólogos; muchos de ellos fueron procesados en los autos de fe de Valladolid de 1559. Especialmente destacado fue el doctor Cazalla (Agustín de Cazalla) predicador y capellán de Carlos V, junto con sus hermanos Francisco, Beatriz y Pedro (hijos de Pedro de Cazalla, contador real, y Leonor de Vibero). Su casa de Valladolid fue derribada y en el solar colocado un padrón de ignominia porque "los herejes luteranos se juntaban en ellas a hacer conventículos contra la fe católica".

Sus hermanos fueron Juan de Cazalla, obispo humanista y erasmista, antiguo capellán del cardenal Cisneros, que intervino en los estudios de Agustín en la Universidad de Alcalá; y el médico Diego de Cazalla, de Palma del Río.

Cuando contaba con 25 años se casó con Lope de Rueda, un rico hacendado con quien compartió su vida en Guadalajara y con el que tuvo seis hijos.

Junto a su hermano Juan y su marido, María se relacionaba con Brianda de Mendoza, Isabel de Aragón y Mencía de Mendoza, de la poderosa familia Mendoza, que presidían la vida social de esa ciudad.

En ella comenzó a frecuentar círculos espirituales liderados por Isabel de la Cruz (una de las primeras doctrinarias del grupo de los alumbrados de la zona de Toledo-Guadalajara) en donde encontró amistad e interés por un cristianismo ajeno al control directo de la Iglesia. María sabía leer, entendía y citaba en latín y contaba con conocimientos de teología. Se formó a través de la lectura y los comentarios que hacían de la misma en los círculos que frecuentaba. Había leído a Erasmo, la Biblia, a Juan Valdés, Agustín de Hipona, Lutero y San Buenaventura que fueron decisivos para su formación espiritual. Sin lugar a dudas, la Inquisición la identificó como peligrosa: por sus orígenes, por tratar con un grupo de alumbrados que practicaba el dejamiento, por sus lecturas, porque transmitía sus conocimientos a otras mujeres y aconsejaba de manera personal sobre cómo podían vivir cotidianamente la fe, porque tenía seguidores (incluso varones), porque desafiaba los dogmas de la iglesia jerárquica al cuestionar los actos externos que la misma imponía, por relativizar el valor de los sacramentos, por sus críticas al estatus de la castidad y entender al estado del matrimonio como superior al monacal.

Mujer autodidacta y profundamente crítica con las convenciones sociales, con ideas transgresoras alejadas de reducir la vida de las mujeres a la maternidad, y de equiparar la sexualidad con el pecado, se convirtió en maestra y dirigente espiritual. Deploraba las bulas para ganar indulgencias, sin cuidarse de la contrición y de la confesión. Realizó una interpretación heterodoxa de los salmos bíblicos y de los textos espirituales de su tiempo: su apropiación de los mensajes bíblicos y de la teología mística franciscana la convirtió en maestra de herejes, y le costó sufrir a la Inquisición.

Fue juzgada como luterana, erasmista y maestra de los alumbrados de Pastrana y Guadalajara entre 1532 y 1534. Fue apresada y encarcelada en 1532, en las celdas de la iglesia de San Vicente. Durante los dos años que duró su detención, contestaba, argumentaba, fue torturada y no delató a su círculo. Mediante sus intervenciones logró desenmascarar argumentativamente a los inquisidores, trabajó junto a su defensor, objetaba testigos a quienes consideraba sus enemigos y llamó a declarar a su favor a sus amigas poderosas de la élite local.

Declaró su aproximación a Erasmo y tomó la distancia que fue posible de Lutero. Esta actitud la llevó a salir con vida de las mazmorras en el año 1535, absuelta. Pero su defensa no le sirvió para librarse de una condena por sospecha leve de herejía, y tras salir de la cárcel, hubo de cumplir penitencia. La Inquisición la obligó a formular una retractación pública en la iglesia de Guadalajara (para intimidación de sus vecinos y para dañar su pública fama), así como a alejarse del grupo de sospechosos de herejía. También se le cobró una multa de 50 ducados por haber mantenido comunicación y correspondencia con otros detenidos durante aquellas noches oscuras vividas en la iglesia de San Vicente. Fue castigada por sus creencias heréticas y por haberse atrevido a actuar como intérprete de los textos de carácter religioso, una actividad que habitualmente se negaba a las mujeres.

La figura de María de Cazalla resulta sumamente interesante para trazar una historia completa de la religiosidad en España durante el siglo XVI, mujer andaluza perteneciente a una familia judeo conversa que vivió en el complejo contexto de efervescencia religiosa de fines del siglo XV, y en el que la Inquisición la contó entre los "herejes" a quienes había que procesar y disciplinar. Perteneciente al círculo heterodoxo de espirituales denominado alumbrados, se ha propuesto como una de las primeras recepciones del protestantismo en España.